Сказка о неправильном дизайне экспериментов
Сказка о неправильном дизайне экспериментов
Опубликовано: 14 дней назадДобавить в избранное

Сказка о неправильном дизайне экспериментов

Сегодня я расскажу вам сказку. Страшную сказку о том, как НЕ НУЖНО планировать эксперименты, или как заблудиться в трех антигенах.
1251

Давным-давно, когда еще Th17 не были так известны, а чекпоинт ингибиторы только набирали обороты, одна маленькая девочка решила померить CTLA-4 на поверхности иммунных клеток. Путь предстоял страшный, через лес рецепторов, болота антител, хищных производителей и, самое важное, через свою гордость, ну и в лес этот пришлось ходить несколько раз. А почему? Расскажем дальше. 


ЧАСТЬ 1. Скупой платит дважды

Девочка решила одним экспериментом посмотреть экспрессию сразу на всех интересных ей клетках: тут и NK, и B-клетки, и моноциты разных типов, и всевозможные T-клетки. И ничего что сводная таблица маркеров, которые нужно было посмотреть, оказалась очень длинной.

В каталоге было много-много разных клонов и разных антител. Она заказала те антитела, которые были дешевле.

Когда пришли антитела, девочка очень обрадовалась. Так обрадовалась, что совсем забыла, что для проверки экспрессии маркеров всегда нужно иметь положительный и отрицательный контроли… Вот и вышла у нее каша: сравнить-то вовсе не с чем.

Вывод: выбирайте контроли для каждого этапа исследования.


ЧАСТЬ 2. Тепло ли тебе, девица?

Сжалились коллеги и одолжили девочке нужные клеточные линии. Всё готово: антитела, идея, контрольные образцы. Ну что может пойти не так? 

Девочка собрала образцы крови у волонтеров и сразу решила поставить эксперимент. Она знала, что антитела нужно титровать, чтобы количество антител было достаточным для правильной окраски всех молекул в эксперименте.

Но только она решила одновременно оттитровать много-много антител, оказалось, что образцов слишком много. И разница между первым и последним образцом во времени была около 6 часов!

Как же так? Оказалось, в начале эксперимента температура в комнате была 18 С, но за 6 часов воздух нагрелся еще на 4. Данные от первых образцов стало невозможно сравнить с данными от последних. Девочка не знала, что система кондиционирования в здании меняется в зависимости от времени.

Вывод: убедитесь, что экспериментальные образцы проходят один и тот же путь: температура, время, объем.


ЧАСТЬ 3. Вместе не всегда веселее

130 образцов готовы. Начинаем! Но почему-то одни антитела не работали вовсе, а другие работали плохо в сочетании с первыми. То тут титрование недостаточное, то там контроли не прошли. 

Девочка потратила много денег и сил, но... всё пришлось начать с нуля.

На второй раз девочка решила проверить заранее все антитела, прежде чем заказать новые. Практически про каждый клон антител ей пришлось прочитать в литературе или попросить кого-то из коллег одолжить немного, чтобы попробовать.

Вывод: всегда проверяйте реагенты и лучше по-отдельности, а не все вместе. 


ЧАСТЬ 4. Кто ещё в теремочке живёт?

Шёл 28-й день путешествия по страшному лесу фенотипирования. Все антитела были оттитрованы, концентрации подобраны и даже проблемы с температурой были учтены. Думаете, это все? Конечно, нет.

В лесу фенотипирования гуляли и другие юные исследователи. Однажды под покровом ночи в один из инкубаторов для клеток попал злой микроб! Его друзья попали в реагенты, а клетки, на которых нужно было проверить экспрессию CTLA-4, заросли лесами бактериальных колоний.

Вывод: увы, очень часто нестерильность работы в стерильных помещениях ведет к серьезным последствиям для экспериментов. 


ЧАСТЬ 5. Жажда крови!

Пришлось начинать заново. И вот беда: образцы крови для эксперимента были обидно потеряны, а доноры не могли пожертвовать кровь снова. Теперь не только новых доноров искать, но и одновременно дезинфицировать все, что было заражено.

Вывод: отсутствие планомерных действий заставляет тратить ресурсы впустую.


ЧАСТЬ 6. Каков вопрос, таков ответ

Доноры были найдены, антитела оттитрованы, эксперимент полностью продуман, контроли готовы, девочка горела желанием наконец-то ответить на свой вопрос: сколько же CTLA-4 на различных клетках?

“Минуточку… да разве это вопрос?”, – засмеялся один пожилой шаман из леса фенотипирования. И объяснил, что в эксперименте вопросы ставятся вовсе не так! 

Вывод: всегда нужно ставить гипотезу, что и почему исследуется в той или иной работе. 

Вот примеры грамотного вопроса: что делает CTLA-4 в различных клетках? Гипотеза: CTLA-4 максимально экспрессирован на регуляторных T-клетках, в отсутствии которых иммунные клетки запускают воспалительный каскад. 


ЧАСТЬ 7. Возвращение к истокам

Когда девочка пришла к шаману с правильным списком вопросов, тот погладил ее по голове и спросил: «Ничего ли ты не забыла?» 

Девочка разозлилась: «Что это он о себе думает, я уже все учла! Странные все они, эти люди леса фенотирирования. Я лучше пойду делать свой эксперимент».

Но не тут-то было. Когда вопросы были правильно заданы, эксперимент пришлось менять, чтобы посмотреть на активацию клеток, их влияние друг на друга, локализацию CTLA-4 в каждой из этих клеток. 

Вывод: начинать нужно с вопроса и гипотезы, а не с заказа антител и огромных, непродуманных экспериментов.


ЧАСТЬ 8. Заключительная 

День ИКС настал! Девочка правильно провела эксперименты и получила огромное количество данных. Счастливая она побежала к компьютеру анализировать результаты. Но … как их сравнивать и анализировать? 

Вывод: метод подсчета результатов должен быть определен до того, как эксперимент проведен, иначе можно ошибиться в количестве образцов и серьезно снизить качество эксперимента. Нужно всегда понимать, какие именно значения будут сравниваться, как они распределены в популяции, количественная или процентная оценка ожидается. 


ЭПИЛОГ. Семь раз отрежь, один отмерь

Ошибок было много. Девочка вышла из леса фенотипирования усталая и без денег на новые реагенты. 

Но пусть эта сказка будет доброй, где наша героиня получила новое финансирование и сделала в итоге грамотный эксперимент.


Не гуляйте по лесам в одиночестве, проводите эксперименты грамотно и наслаждайтесь результатами! 


Экспериментальная сказочница - Айарпи Ездоглян.

Обсуждение статьи и ответы экспертов.

Оставьте свой комментарий.