Плюрипотентные стволовые клетки человека, как модельная система миодистрофии Дюшенна
Плюрипотентные стволовые клетки человека, как модельная система миодистрофии Дюшенна
Опубликовано: 2 месяца назадДобавить в избранное

Плюрипотентные стволовые клетки человека, как модельная система миодистрофии Дюшенна

Осенью 2019 года в Москве прошла конференция BiotechClub 2019, на которой Камила Валетдинова, научный сотрудник Лаборатории клеточной инженерии Новосибирского государственного университета, рассказала о методах терапии наследственного заболевания Миодистрафии Дюшенна, новых разработках и методах тестирования препаратов, а также поделилась опытом получения плюрипотентных стволовых клеток (ПСК).
038

Доклад Камилы Валетдиновой

Конференция BiotechClub 2019

Осенью 2019 года в Москве прошла конференция BiotechClub 2019, на которой Камила Валетдинова, научный сотрудник Лаборатории клеточной инженерии Новосибирского государственного университета, рассказала о методах терапии наследственного заболевания Миодистрафии Дюшенна, новых разработках и методах тестирования препаратов, а также поделилась опытом получения плюрипотентных стволовых клеток (ПСК).


Миодистрофии Дюшенна — это тяжелое наследственное заболевание, причиной которого является мутация в гене дистрофина. Ген дистрофина один из самых больших в геноме человека, он состоит из 79 экзонов, расположен на Х хромосоме, поэтому болезнь развивается в основном у мальчиков и наследуется по материнской линии. Болезнь вызывается делециями или дупликациями одного или нескольких экзонов, либо точечными мутациями в гене дистрофина. Мутации приводят к сдвигу рамки считывания или формированию преждевременных стоп кодонов. В результате такого поврежденного гена синтезируется белок, который не имеет в своем составе важнейших доменов.


Функция дистрофина в организме – стабилизация мышечного волокна. N-концом белок связывается с цитоскелетом (актином) мышечного волокна, а C-концом соединен с основным белком внеклеточного матрикса ламинином. При отсутствии или функциональной недостаточности дистрофина связь между цитоскелетом и соединительной тканью нарушается. Мышцы повреждаются во время сокращения, происходит хроническое повреждение мышечных волокон, воспаление, в результате чего мышечная ткань заменяется на фиброзную жировую и теряет свои функции.

Болезнь манифестирует в возрасте 2-5 лет. К 15 годам наблюдается инвалидизация, а к 30 как правило гибель пациента от сердечной или дыхательной недостаточности.


В настоящее время по всему миру разными группами исследователей ведутся разработки эффективных средств терапии данного заболевания.


Наиболее перспективными являются разработки генной терапии, а именно разработки по доставке белок кодирующих конструкций в организм пациента с помощью аденоассоциированного вируса. Поскольку такие вирусы имеют очень ограниченный размер, то доставляется не целый дистрофин, а как правило его укороченные варианты, так называемые микродистрофины. Испытания, проводимые в настоящее время, должны ответить на ряд ключевых вопросов: на сколько функциональны такие микродистрофины в организме? На сколько стабильны генетические конструкции? На сколько длителен эффект введения? На сколько толерантны пациенты к высоким дозам? Есть ли иммунный ответ? И еще рад нерешенных вопросов.


Другим перспективным направлением является клеточная терапия – это трансплантация не просто стволовых клеток, а миогенных прогениторных, таких как миобласты или мезангиобласты. Данные разработки вызывают еще больше вопросов, например, как доставить большое количество клеточного материала в организм, будет ли эффективна дифференцировка в определенный тип клеток, безопасен ли такой метод терапии.


Существуют и другие типы препаратов, направленные на снижение воспаления и фиброза, но это средства скорее поддерживающей терапии.


Таким образом можно прийти к выводу, что на сегодняшний день нет эффективного лекарственного средства, которое бы обеспечивало воспроизводство нормального дистрофина, либо обеспечивало значимое увеличение его уровня в организме пациента.


Во многом это связано с тем, что препараты, которые оказывают хорошие положительные эффекты на животных моделях, в частности у мышей, при проведении клинических испытаний не показывают таких же значительных положительных эффектов у людей. Кроме того, наблюдаются ранее не обнаруженные побочные эффекты. В связи с этим возникает необходимость тестировать препараты на моделях более приближенных к тому, что мы наблюдаем в организме человека. Такими моделями являются плюрипотентные стволовые клети (ПСК) человека. Они представляют практически неограниченный источник самообновляющихся клеток, которые могут дифференцироваться в любой тип клеток организма в том числе, и в мышечные клетки.


В случае пациента с миодистрофией Дюшенна клетки могут быть получены малоинвазивным способом, например с мочой, перепрограммированы к плюрипотентному состоянию, что занимает около месяца, после чего они будут являться источником новых клеток для пациента, в том числе мышечных.


При проведении направленной дифференцировки ПСК, полученных от пациентов с миодистрофией Дюшенна, показано, что клетки действительно воспроизводят основные фенотипические проявления этого заболевания. Кроме того, дифференцировка воспроизводит ключевые этапы развития мышечных клеток, которые мы можем наблюдать в онтогенезе. Начиная от мезодермы заканчивая скелетными мышцами. Исследования, проведенные на таких моделях, доказывают, что патологические проявления миодистрофии Дюшенна начинаются еще на ранних этапах дифференцировки. И если интерпретировать это на организм человека – еще на ранних стадиях внутриутробного развития. Таким образом плюрипотентные стволовые клети служат моделью для исследования функций самого белка дистрофина, так и моделью для поиска ранних маркеров этого заболевания.


Другое важное применение ПСК — это непосредственное использование для тестирования препаратов. Система редактирования генома активно изучается именно на клеточных моделях. Наиболее популярным методом является использование CRISPR/Cas9 для вырезания поврежденных экзонов, чтобы восстановить рамку считывания. Для более точного восстановления помимо использования CRISPR/Cas9 и дополнительно внесенной донорной молекулы используют механизм гомологичной рекомбинации. Но для использования этой системы есть ряд ограничений:


  • нецелевые эффекты, когда CRISPR/Cas9 разрезает не только ген дистрофина;
  • разная репарация двунитевых разрывов;
  • внесение различных мутаций, к примеру, когда происходит небольшая делеция, вместо точечной мутаций, как замена одной буквы.


Одним из перспективных направлений, которое преодолевает эти вопросы, является «праймированное» редактирование генов. Когда вносится не двунитевой разрыв, а однонитевой, который в клетке репарируется более точным способом. При использовании в данной методике нет необходимости вносить дополнительную матрицу для гомологичной рекомбинации, так как матрица уже содержится в составе направляющей РНК. Преимуществом такой системы является то, что с помощью нее можно редактировать гены в клетках, которые уже не делятся, в частности, в нейронах и мышечных клетках. Как известно в неделящихся клетках гомологичные рекомбинации невозможны. Но с помощью такой системы показано, что в терминале дифференцированных клеток можно внести точечные изменения. Исследователи, изучающие «праймированное» редактирование, считают, что примерно 90% всех мутаций, которые являются причиной многих наследственных заболеваний и аннотированы в международной базе ClinVar, с помощью данной системы можно исправить.


Совместная работа Новосибирского государственного университета и компании BIOCAD по получению клеточной модели миодистрофии Дюшена


Университету были предоставлены мононуклеары крови от двух пациентов с миодистрофией Дюшена. Клетки были перепрограммированы к плюрипотентному состоянию с помощью эписомальных векторов, которые обеспечивают временную экспрессию факторов репрограммирования, но не встраиваются в геном. В результате были получены 32 клона (линии) ПСК от первого пациента, и 16 линий от второго пациента.


3 линии ПСК от первого пациента были нами охарактеризованы. Первым этапом в ходе характеристики был поиск мутаций, поскольку мы не знали наверняка, какой именно тип мутаций в клетках данного пациента. Мы использовали метод секвенирования нового поколения, который позволяет выявить любой тип мутаций. В результате мы обнаружили, что во всех 3 линиях имеется делеция 18-19 экзонов, а также 7 однонуклеотидных замен. Одна из которых находится в экзоне – это миссенс-мутация, которая аннотирована в базе данных ClinVar, как доброкачественная.


С помощью набора тестов фенотипической характеристики мы показали, что клетки действительно являются плюрипотентными, то есть экспрессируют основные маркеры плюрипотентных клеток. Они способны дифференцироваться в производные 3 зародышевых листков: эктодерма, энтодерма и мезодерма. Значит при проведении направленной характеристики мы можем получить мышечные клетки.


В ходе культивирования было показано, что эти клетки сохраняют нормальный кариотип – 46 XY и в процессе культивирования теряют эписомальные вектора, которые использовались на начальном этапе при перепрограммировании.


Таким образом нами была получена клеточная модельная система миодистрофии Дюшена, которая в дальнейшем может быть также скорректирована, например, с использованием биосенсоров, используя которые можно не просто оценивать эффекты, а именно количественно измерять результаты воздействия того или иного препарата на такую клеточную модельную систему. То есть условия теста можно стандартизовать и получать воспроизводимые результаты с использованием этой модели.


Тестирование на данной модели не займет много времени, и через несколько недель можно получить результат. Если учитывать дифференцировку в мышечные клетки, которая может занимать 2-3 недели по разным протоколам. И при условии, что уже есть готовая тест система, к примеру, на основе биосенсоров, которая позволяет измерить флюоресценцию патологического белка.

Обсуждение статьи и ответы экспертов.

Оставьте свой комментарий.